Tarea IV: Clonación y silenciamiento del gen de la polifenol oxidasa en aguacate (Persea americana)

- Introducción: 

Actualmente, el ser humano tiene la capacidad técnica y tecnológica de solventar problemáticas que no se encontraban a nuestro alcance. La agricultura y la industria alimentaria representa uno de los principales sectores donde la biotecnología, y en especial la manipulación de genomas, tiene cabida. He aquí uno de esos ejemplos, del problema a la solución, gracias a la aplicación del saber científico al servicio de la sociedad. 

El aguacate, Persea americana, es un producto económicamente valorado a día de hoy, y uno de los principales problemas que supone en su proceso de comercialización es el tiempo y las condiciones viables de almacenamiento. Se ha identificado una enzima, la polifenol oxidasa, como uno de los principales responsables del oscurecimiento y posterior putrefacción del fruto, a causa del debilitamiento de la barreras físicas por la lisis celular. 

La polifenol oxidasa (PFO) cataliza la conversión de compuestos fenólicos a quinonas (y éstas por su naturaleza inestable polimerizan formando melaninas) en presencia de oxígeno. Como resultado, el aguacate pierde consistencia y adquiere un característico color oscuro, lo que visualmente es menos atractivo para el consumidor, además de que acelera el proceso de descomposición de la fruta. 

Por lo tanto, es de interés económico y social tratar de desarrollar variantes que no exprese, o no en su forma activa, el gen de la polifenol oxidasa. En este documento se detalla el procedimiento experimental para lograrlo mediante los denominados iRNA's puesto que, aunque existen muchas otras opciones viables, este método presenta diversas ventajas técnicas, biológicas, y legislativas, entre otras. 

- Preparación previa: 

El objetivo final del proyecto es producir variantes de Persea americana que no expresen el gen de la polifenol oxidasa, o dicho de otro modo: que los ARNm de la PFO, sean interceptados por los iRNA introducidos en un plásmido, para que acaben siendo degradados por los mecanismos moleculares involucrados en este tipo de ncRNA (Dicer, sistema RISC). 

Un aspecto determinante que debe tenerse en cuenta es la legislación europea acerca del cultivo y comercialización de productos transgénicos. Aunque actualmente la normativa se encuentra en renovación y reasignación de clasificaciones, una variante de aguacate que sea transformada con un plásmido que contenga un iRNA para silenciar el gen de la polifenol oxidasa, se considera un organismo modificado genéticamente (OMG). 

Por ende, previo al cultivo y distribución del producto, éste debe de pasar por un proceso de autorización a nivel europeo que evalúe el caso detenidamente, en función de si puede ser perjudicial para el consumidor o para el medio ambiente, entre otros estándares. Por este motivo, antes de emprender este proyecto biotecnológico sería recomendable analizar las posibilidades respecto a su implementación en los sectores económicos. Con el fin de no generar un activo que no pueda ser comercializado, lo que conllevaría una pérdida de capital, recursos, y de tiempo. 

- Descripción del procedimiento: 

El proyecto consta de varios pasos diferenciables, algunos de carácter teórico y otros práctico, de forma resumida y simplificada éstos son; identificar, aislar y amplificar el gen de la PFO de Persea americana, adquirir un plásmido comercial específico y ligarle el inserto para que se genere un iRNA viable, transformar células meristemáticas vegetales competentes, utilizar un método de selección incluido en el plásmido para distinguir las células recombinantes de las no recombinantes, y generar un organismo transgénico de Persea americana a partir de esas mismas células meristemáticas (y obtener más individuos mediante injertos o micropropagación). 

En primer lugar, para identificar la secuencia que codifica la PFO es necesario remitirse a base de datos especializadas en genomas, como la nucleotide del NCBI. Utilizando el buscador avanzado con las palabras clave polyphenol oxidase y Persea americana no se obtiene ningún resultado adecuado. Ello ocurre porque la búsqueda por texto no es eficaz si se trata de genomas secuenciados enteros (whole sequenced genome),  y no de entradas que contienen genes específicos de una especie determinada. 

Una solución que se ha empleado en este proyecto es la búsqueda por homología a partir de una especie filogenéticamente emparentada, en este caso Cinnamomum micranthum, y se obtuvo el siguiente resultado. Tras lo cual se busca el locus de la PFO (Ctr+F, polyphenol), y se identifica las posiciones de las regiones codificantes (CDS). Para que la búsqueda por homología sea fiable, el exón debe contener varios cientos de pares de bases, por lo que el primero no sería válido, mientras que el segundo sí. A continuación, se realiza un BLASTN desde la misma entrada, y en el buscador se configura las posiciones (14075893..14076553) y la especie de interés (Persea americana). 

Se obtuvieron los siguientes resultados, de los cuales se eligió el primero, y se comprobó mediante BLASTX que codificaba para una PFO. Posteriormente se diseñan los primers para llevar a cabo el procedimiento estándar de una PCR para obtener un fragmento de interés y amplificarlo. Incluso, dependiendo de la situación particular, se podrían diseñar primers que contuvieran en el extremo 5' una secuencia reconocida por una enzima de restricción (ER) que se incluya en el plásmido para, de este modo, facilitar la ligación del inserto y además, al ser necesario en este caso, direccionarlo. 

Una vez amplificado el fragmento mediante PCR (partiendo de una muestra biológica extraída de Persea americana), opcionalmente se podría realizar una electoforesis para confirmar que se ha amplificado el fragmento de interés. Tras ello, se debe adquirir un plásmido que sirva de vector de expresión, es decir, que contenga elementos estructurales añadidos de los que tendría uno de clonación. 

De forma tradicional, el sistema de recombinación por antonomasia han sido las enzimas de restricción, aunque actualmente se han desarrollado muchos otros métodos entre los que se destaca Gateway cloning (clonación Gateway) por ser mucho más eficiente, y que se basa en un mecanismo del fago lambda. Una de las casas comerciales más prominentes en el sector es Collection vector vault, y también destaca la colección de Addgene. En la figura de abajo se muestra el procedimiento técnico que se lleva a cabo para generar un vector de expresión mediante clonación Gateway. 

Un ejemplo típico de vector para Gateway cloning sería el mostrado a continuación, con una región de MCS (multi-cloning site) con un gen de resistencia a calmodulina (Cm) y otro que codifica un gen suicida (ccdB), franqueada por las regiones attL1/2 que son las secuencias reconocidas por la mezcla enzimática conocida como LR clonasa. 

También contiene un ori (origen de repicación) que multica rápidamente el número de plásmidos, y un gen de resistencia a kanamicina. En nuestro caso, se precisa de un elemento más que permita expresar el gen de interés (PFO) de forma abundante, para ello se debe añadir un promotor fuerte de plantas (p35S) y, de ser posible, que sea específico del fruto. Con el propósito de que la transcripción del iRNA de la PFO sea específica de este tejido, lo que evitaría una pérdida de función en el resto de la planta al inhibir la expresión de PFO que quizás cumple un papel en el metabolismo celular. 

Tras haber adquirido el plásmido específico es necesario transformar bacterias de E. coli para amplificarlo ya que, por lo general, la cantidad que envían es ínfima. Para ello no se puede utilizar cualquier tipo de línea celular, se deben usar células competentes (para que puedan captar el ADN exógeno, es decir, el plásmido) y que sean resistentes a ccdB (para que sobrevivan a la selección por ccdB, un compuesto letal que actúa inhibiendo la girasa). 

En el caso de la resistencia a ccdB es casi imperativo comprarlas (pues no se pueden fabricar de novo en el laboratorio), pero las células competentes se pueden elaborar mediante métodos como el shock térmico, por exceso de sales, o electroporación, entre otras alternativas. Respecto a las condiciones de cultivo, para realizar la selección es necesario añadir cloranfenicol (25-30 ug/mL) y kanamicina (50 ug/mL), y un medio de cultivo rico como LB; así solo sobreviven las recombinantes, por lo que se trata de un método de selección positiva. 

Una vez seleccionadas las colonias recombinantes, se extraen los plásmidos mediante una técnica tradicional de purificación de ADN plasmídico como el método de la lisis alcalina, o mediante un kit comercial específico (en función de los requerimientos posteriores), y se comprueba que se haya amplificado mediante una electroforesis en gel de plásmidos digeridos (pues si permaneciesen circularizados no migrarían del modo esperado), o con otras estrategias como la secuenciación WPS (Whole-Plasmid Sequencing) de las NGS, que tienen la ventaja de ser más certeras.  

Después de comprobar que el plásmido se ha amplificado correctamente y en suficiente cantidad, el siguiente paso es ligar el inserto con el plásmido, utilizando la técnica de clonación Gateway. Tras lo cual se transforman bacterias competentes y modificadas de Agrobacterium tumefaciens (vector biológico), y se utilizan los métodos de selección para identificar las colonias recombinantes (como se indica en la imagen de abajo). 

Resulta de suma importancia utilizar bacterias no resistentes a ccdB en este paso para poder llevar a cabo el proceso de selección. De este modo se obtendrán bacterias con un plásmido recombinante con el inserto doble (cadena con y sin sentido) unido por un espaciador (loop), que se utilizarán para transformar células meristemáticas de Persea americana.

Por último, las bacterias de Agrobacterium tumefaciens recombinantes se utilizan como vector biológico para transformar in vitro células meristemáticas del aguacate. De esta forma se obtendrán, tras un periodo de crecimiento, y la disposición de ciertas fitohormonas, de una planta transgénica que expresa un iRNA que, siguiendo con la ruta metabólica de Dicer y la activación del sistema RISC, bloquea la producción de la polifenol oxidasa (disminuyendo el oscurecimiento del fruto). 

Finalmente, para la comercialización de este producto, se llevaría a cabo la micropropagación a partir de este individuo generado, o mediante injertos en plantas previamente cultivadas. Otro método de transformación, aunque generalmente más caro e ineficiente, es el uso de biobalística (bombardeo de partículas de oro o tungsteno) con el plásmido unido por interacciones electroestáticas, favorecidas por un elemento que actúa de puente entre las cargas. 

- Conclusiones sobre el proyecto: 

La característica más notoria de este tipo de proyectos biotecnológicos radica en la versatilidad de la aplicación para la que se puede. No obstante, a lo largo del desarrollo del mismo me he percatado de  diversas limitaciones, tanto burocráticas como técnicas, que presentan. Sin duda el procedimiento aquí descrito es muy burdo, y existen multitud de alternativas que permitirían adaptar el desarrollo experimental, aunque la mayor parte del proyecto es teórico. También se debe analizar con detenimiento cada paso, aplicando las medidas y controles para obtener un resultado acorde. 

Por último mencionar la relevancia de este proyecto en concreto en el ámbito de la agricultura y, en general, al sector agronómico. Ello debido a que supone un método de silenciar o inhibir ciertas rutas metabólicas para obtener un beneficio ya sea económico, de producción, o de almacenamiento, entre otros. Habiendo reflexionado y considerado, por supuesto, sobre los cambios que dicha modificación pueden repercutir a nivel de la célula, del organismo, del consumidor, o incluso del propio ambiente, pues podría conllevar consecuencias graves en diferentes ámbitos.