Tarea I: Protocolo experimental para la clonación del gen de la insulina (versión 2)

Objetivo: Obtener copias funcionales del gen de la insulina.

Consideraciones iniciales: 

El gen de la insulina solo se expresa en las células pancreáticas (islotes de Langerhans). Por lo que no se considera la posibilidad de extraer ARNm a partir de células pancreáticas de un ser humano. El sistema de extracción del material genético será el tejido sanguíneo debido a las ventajas que ofrece frente a otros candidatos. En el caso de una muestra de la mucosa bucal, ésta se encontraría contaminada por el material genético de los microorganismos presentes en la boca. Tampoco se considera la posibilidad extraer la muestra mediante una biopsia del páncreas por las implicaciones éticas, y lo anteriormente expuesto. 

En este caso, se clonará solo la región codificante, es decir, se desestiman las regiones que pertenezcan al promotor y al resto de elementos estructurales que no tengan un efecto  en la síntesis de la insulina (no alteren la secuencia de bases y en consecuencia de la cadena de aminoácidos).

Por otra parte, debido a la escasa estabilidad del ARN (se degrada rápidamente) no se considera, en nuestro caso, su extracción como estrategia para clonar el gen de la insulina. 

Si el objeto último de clonar el gen de la insulina es integrarlo en un sistema de expresión (como las bacterias), existen varios inconvenientes para este propósito; el gen de la insulina contiene intrones que deben ser retirados para que el ARNm madure, y también es necesario considerar que la insulina se sintetiza a partir de una prohormona (concretamente es una preprohormona) llamada proinsulina. Debe pasar por un proceso de proteólisis el cual es llevado a cabo por varias proteasas específicas. 

Protocolo experimental para clonar el gen de la insulina: 

1. Extracción del material genético (ADN) de la muestra de tejido seleccionada: 

La obtención del ADN se lleva a cabo a partir de leucocitos extraídos de una muestra de sangre periférica de un dedo (recolectada mediante una lanceta). Uno de los kits más extendidos es **. Tras obtener la muestra es necesario un procesamiento previo para separar los leucocitos de los eritrocitos (mediante un buffer de lisis como Tris-HCl, y centrifugación), para que no afecte a la calidad de la muestra. Algunos catálogos incluyen kits específicos para extracción de ADN a partir de muestras de sangre, aunque suelen incuir un buffer con componentes que, en este protocolo, no se consideran utilizar. 

Posteriormente se purifica el ADN del resto de componentes citoplasmáticos como proteínas o ARN, con métodos como el "salt-out" (2). Este método consiste en la repetición de ciclos que constan de tres procesos; adición del buffer (cada uno contiene distintos componentes), centrifugación (a unas revoluciones y periodos determinados), y extracción del sobrenadante (fase que contiene las impurezas). El procedimiento se describe con mayor detalle en el documento anexo sobre la técnica, y en el vídeo situado a continuación. 

Figura 1: Protocolo experimental del método "salt-out"

2. Selección de la región concreta del gen de la insulina: 

Para clonar un gen mediante la técnica PCR es necesario que haya cebadores complementarios a  sitios específicos de la secuencia de bases. Por lo general, los cebadores son diseñados por el propio personal de la investigación para que cumpla con los requerimientos experimentales concretos como el número de pares de cebadores, el rango de temperatura adecuada, o si se desea la selección de múltiples segmentos, entre otras consideraciones.  

Algunos ejemplos de herramientas de diseño de PCR son Primer-BLAST proporcionado por el NCBI, a través de la cual también es posible acceder a la secuencia del gen. Las regiones codificantes, también denominadas CDS, del gen de la insulina se encuentran en los intervalos 2424...2610 y 3397...3542 por lo que constan respectivamente de 186 y 145, aunque en ambos casos se añade el nucleótido previo para evitar la pérdida de un nucleótido codificante durante la PCR. Al tratarse de dos CDS se precisan de dos parejas de cebadores, es decir cuatro cebadores, para que se amplifiquen ambas regiones.  

Figura 2: Estructura del gen de la insulina

Algunas consideraciones que se deben tener en cuenta en el diseño de los cebadores son; la relación G-C afecta al rango de temperaturas, el primer con menor valor de Tm es el más inestable (aumenta la tendencia a pegarse), y para que la PCR sea funcional la diferencia de Tm del primer con mayor y menor valor debe ser inferior a 20. Tras su diseño se encargan a empresas biotecnológicas especializadas como Termo Fisher Scientific para que los produzcan y envíen. 

(Añadir figuras de Primer-BLAST sobre el diseño de los cebadores) (3). En este vídeo se explica cómo se utiliza la herramienta Primer-BLAST para diseñar cebadores específicos, aunque en el vídeo no se trata del gen de la insulina en concreto, mantiene el mismo principio. 

Figura 3: Guía de configuración de la herramienta Primer-BLAST 

GAATTCATGGCCCTGTGGATGCGC  

3. Amplificación de la secuencia mediante PCR: 

El siguiente paso es utilizar la técnica PCR (Polymerase Chain Reaction) para amplificar el número de copias del gen de la insulina. Para ello es necesario añadir a la disolución de ADN los cebadores previamente diseñados y encargados, un kit que contenga ADN polimerasa termoresistente, y los nucleótidos trifosfato (NTP's). Tras lo cual se utiliza un termociclador, previamente ajustado según la temperatura, el número de ciclos, y los periodos específicos, para realizar la PCR (4). 

El procedimiento para llevar a cabo una PCR consta de los siguientes pasos (describir los pasos e incuir vídeos explicativos en cada sección) 

PCR para secuenciar el gen o para clonarlo (procedimientos distintos) Chromas (Technelysium) Opciones, Auto Y zoom. Tres fases de lectura (nucleótidos, aa). Las primeras 15-25 bases se pierden (N). 

4. Purificación del ADN mediante electroforesis en gel de agarosa:

(Procedimiento de elaboración del gel de agarosa %, de la electroforesis, y de la extracción de la banda de ADN de los fragmentos amplificados de la matriz de agarosa, ¿sería recomendable utilizar NanoDrop para analizar la calidad de la muestra?)

Por lo general, se usan kits específicos de separación de ADN del gel de agarosa (Purificación de los fragmentos de ADN del gel de agarosa) También existen técnicas alternativas que no requieren kits (5). 

5. Secuenciación Sanger de los fragmentos de ADN aislados:

Valoración personal sobre el procedimiento:

Principales artículos de referencia (incompleto):

- 1. Fedchenko, V. I., Egorova, A. A., Gur'ev, S. O., Valyaev, A. M., Arslan, A., Tyalina, Y. Y., ... & Zhdanov, R. I. (1994). A plasmid vector for expressing the human insulin gene in nonendocrine cells. Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 118(4), 1140-1143.

- 2. Shokrzadeh, M., & Mohammadpour, A. (2018). Evaluation of a modified salt-out method for DNA extraction from whole blood lymphocytes: A simple and economical method for gene polymorphism. Pharmaceutical and Biomedical Research.

- 3. Bustin, S., & Huggett, J. (2017). qPCR primer design revisited. Biomolecular detection and quantification, 14, 19-28.

- 4. Asif, S., Khan, M., Arshad, M. W., & Shabbir, M. I. (2021). PCR optimization for beginners: a step by step guide. Research in Molecular Medicine, 9(2), 81-102.

- 5. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., & Liao, D. J. (2012). A quick, cost-free method of purification of DNA fragments from agarose gel. Journal of Cancer, 3, 93.