Tarea I: Protocolo experimental para la clonación del gen de la insulina (versión 1)

Objetivo: Obtener copias funcionales del gen de la insulina.

Consideraciones iniciales: 

El gen de la insulina solo se expresa en las células pancreáticas (islotes de Langerhans). Por lo que no se considera la posibilidad de extraer ARNm a partir de células pancreáticas de un ser humano. El sistema de extracción del material genético será el tejido sanguíneo debido a las ventajas que ofrece frente a otros candidatos. En el caso de una muestra de la mucosa bucal, ésta se encontraría contaminada por el material genético de los microorganismos presentes en la boca. Tampoco se considera la posibilidad extraer la muestra mediante una biopsia del páncreas por las implicaciones éticas, y lo anteriormente expuesto. 

En este caso, se clonará solo la región codificante, es decir, se desestiman las regiones que pertenezcan al promotor y al resto de elementos estructurales que no tengan un efecto  en la síntesis de la insulina (no alteren la secuencia de bases y en consecuencia de la cadena de aminoácidos).

Por otra parte, debido a la escasa estabilidad del ARN (se degrada rápidamente) no se considera, en nuestro caso, su extracción como estrategia para clonar el gen de la insulina. 

Si el objeto último de clonar el gen de la insulina es integrarlo en un sistema de expresión (como las bacterias), existen varios inconvenientes para este propósito; el gen de la insulina contiene intrones que deben ser retirados para que el ARNm madure, y también es necesario considerar que la insulina se sintetiza a partir de una prohormona (concretamente es una preprohormona) llamada proinsulina. Debe pasar por un proceso de proteólisis el cual es llevado a cabo por varias proteasas específicas. 

Protocolo experimental para clonar el gen de la insulina: 

1. Extracción del material genético (ADN) de la muestra de tejido seleccionada: 

El material genético (ADN) se extraerá a partir de un pequeño volumen de sangre. Tras obtener la muestra biológica se realiza el procesamiento (2) para obtener ADN a partir de los leucocitos. Además también es necesario purificarlo, es decir, separar el ADN del resto de componentes celulares.

2. Selección de la región concreta del gen de la insulina: 

Una vez purificado el ADN, y previo a la clonación del gen de la insulina, es necesario añadir cebadores. Por lo general, los cebadores son previamente diseñados (3) por el propio personal del grupo, con herramientas como Primer-BLAST, para de ese modo satisfacer los requerimientos experimentales específicos de la investigación. Posteriormente son encargados a empresas biotecnológicas como Termo Fisher Scientific para que los produzcan. 

3. Amplificación de la secuencia mediante PCR: 

El siguiente paso es utilizar la técnica PCR (Polymerase Chain Reaction) para amplificar el número de copias del gen de la insulina. Para ello es necesario añadir a la disolución de ADN los cebadores previamente diseñados y encargados, un kit que contenga ADN polimerasa termoresistente, y los nucleótidos trifosfato (NTP's). Tras lo cual se utiliza un termociclador, previamente ajustado según la temperatura, el número de ciclos, y los periodos específicos, para realizar la PCR (4). 

4. Secuenciación con Sanger de los frgamentos obtenidos:

Principales artículos de referencia (incompleto):

- 1. Fedchenko, V. I., Egorova, A. A., Gur'ev, S. O., Valyaev, A. M., Arslan, A., Tyalina, Y. Y., ... & Zhdanov, R. I. (1994). A plasmid vector for expressing the human insulin gene in nonendocrine cells. Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 118(4), 1140-1143.

- 2. Shokrzadeh, M., & Mohammadpour, A. (2018). Evaluation of a modified salt-out method for DNA extraction from whole blood lymphocytes: A simple and economical method for gene polymorphism. Pharmaceutical and Biomedical Research.

- 3. Bustin, S., & Huggett, J. (2017). qPCR primer design revisited. Biomolecular detection and quantification, 14, 19-28.

- 4. Asif, S., Khan, M., Arshad, M. W., & Shabbir, M. I. (2021). PCR optimization for beginners: a step by step guide. Research in Molecular Medicine, 9(2), 81-102.