Blog: Biosíntesis de Macromoléculas

  Tarea II: Corrección de un cromatograma Antes de empezar (y a modo de introducción)... ¿Qué es un cromatograma?  Un cromatograma, según la definición habitual, es una representación gráfica/visual de los resultados obtenidos en un análisis cromatográfico, mostrando la separación entre los componentes. En concreto, un cromatograma de secuanciación Sanger muestra los picos de colores correspondientes a cada nucleótido, identificado en una electroforesis capilar. Ello permite determinar, de forma más o menos concluyente, la secuencia de una cadena de ADN específica. ¿Cómo se realiza un cromatograma? Se genera tras una reacción de técnica de PCR denominada PCR de terminación de cadena, utilizando dideoxinucleótidos fluorescentes (paralizan la replicación al polimerizarse), seguida de electroforesis capilar automatizada que permite separar los fragmentos por tamaños. Al final del capilar, un láser excita los fluorocromos de los ddNTP's marcados, y un detector registra los picos d...

Objetivo : Obtener copias funcionales del gen de la insulina. Consideraciones iniciales:  El gen de la insulina solo se expresa en las células pancreáticas (islotes de Langerhans). Por lo que no se considera la posibilidad de extraer ARNm a partir de células pancreáticas de un ser humano. El sistema de extracción del material genético será el tejido sanguíneo debido a las ventajas que ofrece frente a otros candidatos. En el caso de una muestra de la mucosa bucal, ésta se encontraría contaminada por el material genético de los microorganismos presentes en la boca. Tampoco se considera la posibilidad extraer la muestra mediante una biopsia del páncreas por las implicaciones éticas, y lo anteriormente expuesto.  En este caso, se clonará solo la región codificante, es decir, se desestiman las regiones que pertenezcan al promotor y al resto de elementos estructurales que no tengan un efecto  en la síntesis de la insulina (no alteren la secuencia de bases y en consecuencia de l...

1. Muestra de sangre: Si el tratamiento se realizase directamente sobre la muestra, se obtendría una disolución con el contenido citoplasmático de los leucocitos y de los eritrocitos. Por lo que es necesario aplicar un tratamiento previo (enfriamiento/congelación y buffer Tris-HCl con MgCl2) para debilitar las membranas de los glóbulos rojos y después centrifugar la disolucion.  Posteriormente se añade un agente químico (buffer con EDTA, SDS, Tris-HCl, y NaCl) que lise las membranas celulares de los leucocitos, liberando el contenido celular (ADN, ARN, proteínas). Junto con perclorato de sodio y el agente quelante (EDTA), las proteínas se insolubilizan formando cúmulos visibles lo que facilita su separación parcial del ADN.  Para separar el remanente de proteínas se añade cloroformo líquido, se centrifuga (formándose tres fases), y se descarta la fase que contiene las proteínas. Seguidamente se añade etanol y se centrifuga para, de este modo, eliminar el cloroformo. Como últim...

Objetivo : Obtener copias funcionales del gen de la insulina. Consideraciones iniciales:  El gen de la insulina solo se expresa en las células pancreáticas (islotes de Langerhans). Por lo que no se considera la posibilidad de extraer ARNm a partir de células pancreáticas de un ser humano. El sistema de extracción del material genético será el tejido sanguíneo debido a las ventajas que ofrece frente a otros candidatos. En el caso de una muestra de la mucosa bucal, ésta se encontraría contaminada por el material genético de los microorganismos presentes en la boca. Tampoco se considera la posibilidad extraer la muestra mediante una biopsia del páncreas por las implicaciones éticas, y lo anteriormente expuesto.  En este caso, se clonará solo la región codificante, es decir, se desestiman las regiones que pertenezcan al promotor y al resto de elementos estructurales que no tengan un efecto  en la síntesis de la insulina (no alteren la secuencia de bases y en consecuencia de l...