Material complementario de la Tarea I

1. Muestra de sangre:

Si el tratamiento se realizase directamente sobre la muestra, se obtendría una disolución con el contenido citoplasmático de los leucocitos y de los eritrocitos. Por lo que es necesario aplicar un tratamiento previo (enfriamiento/congelación y buffer Tris-HCl con MgCl2) para debilitar las membranas de los glóbulos rojos y después centrifugar la disolucion. 

Posteriormente se añade un agente químico (buffer con EDTA, SDS, Tris-HCl, y NaCl) que lise las membranas celulares de los leucocitos, liberando el contenido celular (ADN, ARN, proteínas). Junto con perclorato de sodio y el agente quelante (EDTA), las proteínas se insolubilizan formando cúmulos visibles lo que facilita su separación parcial del ADN. 

Para separar el remanente de proteínas se añade cloroformo líquido, se centrifuga (formándose tres fases), y se descarta la fase que contiene las proteínas. Seguidamente se añade etanol y se centrifuga para, de este modo, eliminar el cloroformo. Como último "cribado" se vuelve a añadir etanol, se diluye con agua, se centrifuga de nuevo, y se separa la fase líquida del pellet (ADN) el cuál se congelará. 

Añadir también que bajo ciertas circunstancias (valores bajos de absorbancia, valores atípicos de espectrofotometría, presencia de regiones sombreadas en el gel de agarosa tras electroforesis), es recomendable añadir ARNasa que degraden el ARN presente en la muestra. Ello con el objetivo de mejorar los resultados en los posteriores procesos de PCR y diseño de cebadores específicos. 

¿Por qué este método y no otros? Parece ser un método (denominado como método salino "salt-out") que destaca por su sencillo procedimiento, su escaso coste económico, y por ser especialmente útil al tratar con muestras de tejido sanguíneo (linfocitos). También lo he elegido porque ha demostrado buenos resultados (NanoDrop) respecto a la cantidad y la calidad del ADN obtenido (espectrofotometría y electroforesis en gel de agarosa). Los autores señalan que mediante este procedimiento se evita el uso de enzimas costosas , como la proteinasa K o la RNasa A, sin una pérdida notable de rendimiento o calidad. 

2. Selección de la región concreta del gen de la insulina: 

*Diseño y uso de cebadores/primers, consideraciones a tener en cuenta en el caso de la insulina (intrones, exones, CDS útiles, Tm, espacio entre las regiones)